A következő években a vár többször gazdát cserélt Szapolyai János és Habsburg Ferdinánd hívei között. Olyan eset is előfordult, amikor Egernek két püspöke is volt, az egyiket János, a másikat Ferdinánd király nevezte ki, sőt, mindkét uralkodó nemegyszer világi főuraknak is eladományozta az egri püspökség javadalmait. A reformáció egri megjelenése is ezzel hozható összefüggésbe. Az új hit elsőként a Felvidéken, illetve Észak-Magyarországon kezdett el terjedni, olyan világi hatalmasságok közreműködésével, mint a Homonnai-Drugethek, a Drágffyak, vagy a Perényiek. Egerben Perényi Péter közreműködésével jelent meg, aki a mohácsi események idején koronaőr volt. 1541-ig a nemzeti király, Szapolyai pártján állt, 1541 után pedig átállt Ferdinánd oldalára, akinek jóvoltából hamarosan az ország kancellárja és főkapitánya lett. 1542-ben megszállta az egri várat azzal az ürüggyel, hogy az, mint az ország egyik fontos támaszpontja, megmaradjon Ferdinánd kezén. Perényi azonban ezt követően a várat saját tulajdonába vette, és kiszorította onnan a király embereit. Azok közé a magyar főurak közé tartozott, akik családjukkal együtt már 1530-ban csatlakoztak a reformációhoz. Noha ő 1542-ben fenti magatartása miatt felségárulás vádjával börtönbe került, az egri várat várnagyára, Varkoch Tamásra bízta, akinek nevéhez fűződött az első lutheránus eklézsia megszervezése Egerben. Az új hit itteni terjedésének rendkívüli módon kedvezett, hogy Frangepán Ferenc püspök halála után 1543-tól 1548-ig betöltetlen maradt az egri püspöki szék, és Oláh Miklós, a Mária özvegy királyné kíséretében Hollandiát megjárt rendkívüli műveltségű főpap - aki 1548-ban lett Eger püspöke - sem tartózkodott székhelyén, mert egyidejűleg kancellár is volt. Perényi börtönben történt halála után annak Gábor nevű fia kénytelen volt a várat a hozzátartozó birtokokkal együtt visszaadni Ferdinánd királynak.

1548-tól Dobó István lett a vár kapitánya. Ezzel megszűnt a protestáns uralom, hiszen maga Dobó katolikus volt, de a püspöki jövedelmek nagy részét Oláh Miklós püspök korábbi áldozatkész felajánlása alapján továbbra is a várra kellett fordítani. Az egri vár jövedelmeit a király és a püspök által kötött szerződés alapján három részre kellett osztani, egyharmadát a püspökség élvezte, egyharmadát a vár megerősítésére, egyharmadát pedig a várőrség ellátására kellett költeni. Erre azért volt nagy szükség, mert Buda 1541-ben történt elfoglalása után a megmaradt országrész legfontosabb védőbástyája Eger lett, és az erődítményt fel kellett készíteni a várható ostromra. Dobó megkezdte a püspöki jövedelmek szigorú behajtását és vár megerősítését. Tévedés azonban azt hinni, hogy Dobó nevéhez fűződik a várbeli katedrális megsemmisítése, hiszen az már a korábbi években, a protestánsok és a katolikusok közt dúló harcokban olyan károsodásokat szenvedett, hogy alkalmatlanná vált funkciójának betöltésére. Ettől kezdve az egyházmegye fő temploma a Szent Mihály plébániatemplom volt. A protestantizmus terjedésével és a katolikus egyház megújulásának szükségességével hozható összefüggésbe a jezsuita rend megalakulása, majd annak magyarországi megtelepítése 1560 körül, ami Oláh Miklós esztergomi érsek, korábbi egri püspök nevéhez fűződik.

Az új hit rohamos térhódítása mellett az oszmán birodalom terjeszkedése jelentette a legnagyobb veszélyt a püspökségre, illetve annak székhelyére. 1552 nyarán Ahmed fővezér elfoglalta Temesvárt, ez alatt Ali budai basa pedig az itteni helyőrséggel Drégelyt, Szécsényt, Hollókőt és Bujákot. Ezt követően szeptember elején a két sereg Szolnok alatt egyesült. A szolnoki erődítmény idegen zsoldosokból álló őrsége szeptember 6-án kiszökött a várból. Ez hatalmas csapást jelentett Egerre, hiszen Dobónak nem maradt elegendő ideje arra, hogy feltöltse az egri vár védőinek létszámát, Tinódi szerint 1935 védővel volt kénytelen szembeszállni a 150 ezer főt kitevő két egyesült török sereggel, akik szeptember 14-én vették ostromzár alá az egri várat. A zsoldos katonák közé így kénytelen volt fölvenni a környék lakosságából verbuválódott önkénteseket és a fegyverforgatásban jártas jobbágyokat is.

Az október 13-i, utolsó, sikertelen roham után egyes kisebb hadtestek megkezdték az elvonulást. Október 17-én Ahmed Belgrád felé, Ali basa pedig Buda irányába vezette seregeit. A győzelem Európa-szerte óriási szenzációt keltett, Eger, mint a kereszténység védőbástyája szerepelt a köztudatban.

Az 1552-es ostrom után a várkapitány utódok révén - különösképpen Mágóchy Gáspár segítségével - tovább terjedt a protestantizmus. Emiatt a püspök nélkül maradt káptalan a várból a Szent Mihály templomba szorult ki, de néhány év múlva onnan is menekülniük kellett. Amikor 1564-ben, az egri protestáns zsinatra Mágóchy meghívására maga Méliusz Juhász Péter érkezett Debrecenből, helybeli katolikus papok híján már csak világi nemesekkel tudott hitvitát folytatni.